滴（dī）眼給藥（yào）毒性試（shì）驗的目的（de）

滴眼給藥毒（dú）性試驗是重（chóng）複給藥一般毒性（xìng）試（shì）驗（yàn），主要用於研發滴眼藥物。歐盟發布的《醫療用品（pǐn）非臨（lín）床局部耐受性試驗指導（dǎo）原則》（CPMP/SWP, 2001）明確規定了單次給藥和重（chóng）複給藥眼部耐受性試驗的（de）相關事宜。美國食品藥品監督管理局（jú）發布（bù）的《藥品以（yǐ）及可替代性給（gěi）藥藥品非臨床（chuáng）安（ān）全性評價指導（dǎo）原則草案》（FDA/CDER, 2008）則明確要求在滴眼給（gěi）藥時應開展係統藥代動力學（PK）和眼科（kē）檢查（chá）（包（bāo）括裂隙燈顯微鏡檢查、眼底檢查、眼壓（yā）測量及組織病理學檢查）。然而，這兩份指導（dǎo）原則中的相關（guān）規定均較簡要（yào），缺乏滴眼給藥毒性試驗詳（xiáng）細設計（jì）的具體內容。目前，尚無滴眼給（gěi）藥毒性試驗（yàn）的確（què）切定義。日本（衛生福利部，1999）依據ICH M3指導原則（ICH, 2009）和ICH S4指導原則開展滴眼給藥（yào）毒（dú）性試驗。這些原則通常適用於係統給藥的藥物。

有（yǒu）人常常將滴眼給藥毒性（xìng）試驗與眼刺激試驗混為一談。實際上，滴（dī）眼毒（dú）性預試驗、一周或兩周的重複（fù）給藥滴眼毒性試驗的方案與眼（yǎn）刺激試驗（yàn）的方案有相似（sì）之處（OECD, 2012）。

目前（qián），眼刺激試驗通常使用兔子進行（háng），以評估化學物質（zhì）在（zài）粘膜給藥（yào）或人體偶然接觸時的安全性（OECD, 2012）。眼刺激試驗的主要目的（de）是檢測眼表的刺激或腐蝕反應。

相比之下，滴眼給藥毒性試驗的主要目（mù）的是評估眼科藥物的一般毒性。因此（cǐ），滴眼（yǎn）給藥毒性試驗的（de）檢查項目包括組織病理學檢查、眼部附屬器以及（jí）全身髒器的評價。這兩種試驗的差（chà）異見表1。

表1 滴眼給藥（yào）毒性試驗和眼刺激試驗的差異

滴眼給藥毒性試驗的設計

01、動物物種

根據ICH M3指（zhǐ）導原則，一般毒性試驗需選擇兩種動物（ICH, 2009）。通常情況下，會從（cóng）齧齒類動物（如兔或小（xiǎo）鼠）和非齧齒類動物（犬（quǎn）或猴）中各選一種。然而，在過去十年間（2005~2016），經日本衛生勞動福（fú）利部（MHLW）批（pī）準，約九成的滴眼液在研發過程中，將兔作為開展滴眼給（gěi）藥毒（dú）性試驗的首選（xuǎn）實驗（yàn）物種，其次常用的（de）實驗物種是猴（幾乎全部是食蟹猴），再然後是犬（見表2）。因此，滴眼給藥毒性試驗通（tōng）常選擇（zé）兩種非齧齒類動物。不過，動物物種（zhǒng）的選擇是根據（jù）具體情況而定的。因此，在評估某些藥物時，可能僅使用一個物種（比如（rú）兔或食（shí）蟹猴）。

表（biǎo）2 2005~2016日本滴眼液滴眼給藥毒（dú）性（xìng）試（shì）驗的獲批的動物物種 

注：信息來源於日本醫藥和醫療器械局（PMDA）主頁

近來發表的多篇文章從眼部安全性評（píng）估的角（jiǎo）度（dù）出發，討論了各（gè）個實驗物種的特（tè）點，並對不同實（shí）驗物種作（zuò）了比較。各（gè）物種的特點如下。

兔

兔的眼球重量約為人眼的一半，眨眼頻率（每6分鍾一次）明（míng）顯低於人類的眨眼頻（pín）率（每5秒鍾一次）。此（cǐ）外（wài），兔的角膜比人類的角膜薄。基於這（zhè）些特點，並考慮到影響藥物角膜滲透能力的（de）因素，有研究（jiū）者預計（jì），在滴入滴眼液後，兔眼的藥物暴露水平相（xiàng）對較高。McDonald和Shadduck（1977）認為兔相較於其他實驗動物對眼刺激（jī）物更為敏感。使用兔（tù）進行試（shì）驗的其他原因還包括較低的動物成本以（yǐ）及基於大（dà）量供試品積累的曆史數據。

在進行滴眼給藥毒性試驗時，特別（bié）需注意選擇色素（sù）兔還是白化兔。由於供試品能夠與色素兔體內的色素結合，因此（cǐ）在毒（dú）性評估時，色素兔更具優勢。關於色素兔，荷蘭帶（dài）兔比新西蘭大白兔和新西蘭紅兔（F1代兔）更常用於滴眼給藥毒性試驗。Durairaj等人（2012）報告（gào）稱，人（rén）、食（shí）蟹猴、犬、豬（zhū）、F1代兔和荷蘭帶兔的眼部（bù）黑（hēi）色素含量存在差異，而且不同（tóng）物種之間眼睛各部（bù）分的黑色素含量也不同。另外，值得一提的是，荷蘭帶兔的眼球比新西蘭大白兔或日本白兔的小。

猴

盡管食蟹猴的眼（yǎn）球（qiú）重量僅（jǐn）約為人眼的一半，但其解剖特征與人類相似。例如（rú），食蟹猴的角膜和晶狀體相對較小，眼（yǎn）底有黃斑。Shibuya等人（2015）建（jiàn）議將食蟹猴用作實驗動物，因為它們的眼睛有助於詳細評估藥物誘導的黃斑病變毒性。食蟹猴的眨眼頻率與人類相似。與人類一（yī）樣，食蟹（xiè）猴既沒有瞬膜，也沒（méi）有哈氏（shì）腺，而兔、犬和豬（zhū）則都（dōu）有瞬膜和（hé）哈氏腺。食蟹猴和犬一樣，也用（yòng）於係統（tǒng）毒性試驗。利用（yòng）相關（guān）物種可以獲得（dé）毒理學數據，彌合局部給（gěi）藥和係統給藥在同（tóng）一物種中產生的結果（guǒ）差異。與人（rén）類相比（bǐ），食（shí）蟹猴的眼組織黑色素含量相對較高。在猴類（lèi）中，視神經（jīng）退化常見於恒河猴和食蟹猴，且被認為（wéi）是自發（fā）性先天視神經病變。

犬和豬

針對（duì）特定目的飼養的比格犬的眼球重量約為5.5克，約為（wéi）人眼（yǎn）重量的0.8倍（bèi），而豬的眼球大小接近（jìn）人眼。從眼球的絕對（duì）尺（chǐ）寸（cùn）來看，犬和豬在藥物局（jú）部效應評估方麵具有優勢（shì），因為眼組織的厚度和長度（dù）是決定局部給藥（yào）藥物滲透性和分布的重要因素。犬和豬的眼部解（jiě）剖特征相似，例如，與靈長類動物相比，它們的晶狀體在眼（yǎn）球（qiú）中占據的體積相對較大。另一方麵，犬的（de）脈絡膜上有（yǒu）毯氈（zhān）層，而豬、兔或（huò）食蟹猴（hóu）則沒有。目前（qián），犬和豬不常用於滴眼給藥毒（dú）性試驗，尤其是豬。然而（ér），這類動物在滴眼給藥毒（dú）性試驗中仍有（yǒu）其獨（dú）特的優勢，理由如下：1. 基於上述解剖（pōu）和生理特點，模仿人體藥物分布的可能性較（jiào）高。2. 與兔和食（shí）蟹猴相比，由於犬和豬（zhū）的體型相對較（jiào）大，通過（guò）係統給藥出現的藥物反（fǎn）應更少。

02、性別

根據一般毒（dú）性試驗指導原則（衛生福利部，1999），滴眼（yǎn）給藥毒性試（shì）驗應在兩種性別的動物上進行。人類、恒河猴和兔的眼軸長度存在性別差異，但眼球（qiú）尺寸（cùn）的性別差異卻極其微小。Wagner等人（rén）（2008）研究了健康人眼和患病人眼的性別差異，認為性激素影響了（le）不同性別在患病狀態下的淚腺係統、眼瞼和眨眼頻（pín）率、以及角膜的解剖（pōu）和特征。一般而言，幹眼流（liú）行病學研究表明女性幹眼（yǎn）發病率（lǜ）比男性高（gāo）。然而，實驗動（dòng）物的眼睛（jīng）是否存在顯著的性別差異尚不明確（què）。是否在滴（dī）眼給藥毒性試驗中使（shǐ）用兩種性（xìng）別，尤其僅進行眼（yǎn）毒性評估的試驗，仍有待進一（yī）步（bù）討論。

03、給藥

劑（jì）量和濃度（dù）

根據ICH M3指導（dǎo）原則（ICH，2009），一般（bān）毒性試驗的高劑量水平設定（dìng）為最大耐受量（MTD）、最大（dà）給藥量（MFD）或人體暴（bào）露量的50倍。這（zhè）一設定原則同樣適用於滴眼給（gěi）藥毒性試驗。在某些情況下，高劑量水（shuǐ）平可以基於局部耐受性預試驗的結果來確（què）定。然而，在大多（duō）數（shù）情況下，滴眼給藥毒性試驗的高劑（jì）量水平是根（gēn）據MFD設定（dìng）的，主要是由於製劑製備的某些內在（zài）因素。

供試品的角膜滲透性主要取決於製劑（jì）的特性。為了獲得有意義的風險評估結果，權威性（xìng）滴眼給藥毒性試驗（yàn）（例如首次人體試（shì）驗之前開展的GLP試驗）所用的供試製劑應與臨床試驗所用的製劑（jì）一致或相近。供試（shì）品的濃度主要是根據其在製劑中的溶（róng）解度來定義的。至於製劑（jì）的（de）調整（zhěng），其他特性（xìng）（如滲透壓、pH值和賦形劑）也十分重（chóng）要（yào）。滴眼液製劑的酸堿度應在可接受的生理範圍內。選擇防腐劑時，需避免其濃度達到引起毒性（xìng）反應的（de）水平。例如，有研究者發現，眼科製劑中常用的防腐劑苯（běn）紮氯銨在局部給藥時會誘發角膜變化。因此，眼科製劑中防腐劑的濃（nóng）度是有限製的。因此，在大多數情況下，滴眼給藥毒性（xìng）試驗所設的（de）最高劑量水平是基於受試製（zhì）劑的最大給藥量，而非（fēi）供試品本身的特性來決（jué）定的。

滴眼體積

兔子的眼瞼較為鬆弛，結膜囊較大，因此能容（róng）納較大的滴眼液體積。根據OECD眼刺激試驗指導原則，兔子的滴眼（yǎn）體積為（wéi）0.1 mL（OECD, 2012）。該（gāi）體積約為臨床標準滴眼（yǎn）液用藥體積（jī）（約0.04 mL）的兩（liǎng）倍。從經驗來看，不同物種的（de）最（zuì）大滴眼體（tǐ）積並不相同。例如，比格犬（quǎn）和兔子的最大可行體積（jī）相似，而食蟹猴的最大可行體積則是比格犬和兔子的（de）兩倍多。

需注意的是，眼部暴露量並不會隨（suí）著（zhe）滴眼體積的增加而成比（bǐ）例增加，因為部分（fèn）多餘（yú）的液體會通過鼻淚管流失。Lambert等（1993）假定在眼刺激試驗中，如果滴眼體（tǐ）積為0.01 mL（建（jiàn）議供試體積的十分之一），藥物與人眼刺激感受的相關性更佳（jiā）。因此，滴眼給藥毒性試驗的滴眼體積可能需進一步討論。增加滴眼體積並不能有效提高眼部暴露量，反而可能（néng）導（dǎo）致係統暴露量增加，甚至引發（fā）意料之外的係統毒性反應。

單（dān）眼/雙眼給藥

供試品是單眼給藥還是雙眼給藥需慎重（chóng）考（kǎo）慮。從（cóng）動物福利的（de）角度出發，若無特殊（shū）原因，應將供試品（pǐn）滴入單側眼睛。如一隻（zhī）眼給予供試品，另一隻眼則不給藥（yào）（即不接觸供試品），或（huò）給予對照品（pǐn）（例如溶媒製劑）作為對照。然而（ér），嚴格來說，對照眼由（yóu）於係統循環的影響，可能也會接（jiē）觸到供試（shì）品（pǐn）。因此，在評估對照眼的結果時，應該考慮到這一潛在的接觸因素。

給藥頻率

在標（biāo）準的口服或（huò）靜脈給藥一般毒（dú）性試驗中，通常每天給藥一次（cì）；而在滴眼給藥（yào）毒性試驗中，通常一天給藥（yào）多次。非臨床試驗的滴眼頻率通常高於臨床試驗的給藥頻率。例如，非（fēi）臨床（chuáng）試驗中可能每（měi）天滴眼4次，而臨床試驗（yàn）中則每天滴眼（yǎn）2次。滴眼給藥（yào）毒性試驗（yàn）設定較高的給藥（yào）頻（pín）率，旨在獲得更高的重複暴露量，特別是在供試品的生化特征導致最大藥物濃度難以增（zēng）加時更為（wéi）重要。Chrai等人（1974）報（bào）告稱，如果兩次（cì）滴眼間隔5分鍾，就能（néng）有（yǒu）效地（dì）增加兔的眼部暴露量。許多滴眼給藥毒性試驗的給藥（yào）頻率是臨床給藥頻率的1.5到2倍。然而，給藥過於頻繁雖可提高（gāo）暴（bào）露水平，但也增加操作的次（cì）數，從而增（zēng）加動物保定的頻率，這可能（néng）導致動物應激，進而引（yǐn）發倫理問題。因此，在設計滴（dī）眼給（gěi）藥毒性試驗時，需在提高暴露水平和減少動物應激之（zhī）間找到平衡（héng）點（diǎn），以確保試驗的科（kē）學性（xìng）和倫（lún）理性。

04、眼及附屬組（zǔ）織檢查

常規/標準眼科學檢查

滴眼給藥毒性（xìng）試驗目前尚無統一的眼部（bù）和係統檢查項目（mù）。OITSs的（de）眼科學檢查是基於係統藥物一般毒性評估指導原則進行的，涵蓋了眼前節、眼內介質和眼底等所有組織（zhī）的檢查（ICH, 1999）。然而，由（yóu）於滴眼給藥直接作（zuò）用於眼部（bù），滴眼給藥毒性試驗的眼科學檢查更加詳（xiáng）細，涵蓋的檢查項目也更多。Weir和Wilson（2013）列出了非臨床眼毒性試驗（yàn）的標準眼（yǎn）部安全性終點，這些終點具有重要的借鑒（jiàn）意義。檢（jiǎn）查項目包括：大體（tǐ）觀察（chá）、裂隙（xì）燈生（shēng）物顯微鏡檢（jiǎn）查、眼底檢眼鏡檢查（chá）、眼壓測量、視網（wǎng）膜電圖和組織病理學。

基於相關指導原則和知識，表3總結了滴眼給藥毒性試驗（yàn）的常規及可選眼科（kē）檢查項目。由於眼前節的供試品濃度較高，因（yīn）此對眼前節進行觀察和檢查尤（yóu）為重要。除（chú）標（biāo）準的大體觀察外，采用評分方法進（jìn）行詳（xiáng）細觀察對於評估眼（yǎn）毒性的嚴重程度非常關鍵。例（lì）如，Draize評分（fèn）法用於角膜、虹膜和結膜的大體（tǐ）觀察。McDonald Schadduck評分和Hackett-McDonald評分常（cháng）應用（yòng）於滴眼給藥毒性試驗中，二者對（duì）裂隙燈顯微鏡檢查結果進行評分。特別是，Hackett-McDonald評分能對眼睛進行全麵評估，包括（kuò）對晶體和（hé）瞳孔光反射的評估。

表3 滴眼（yǎn）給藥毒性試驗（yàn）的常規或可選眼（yǎn）科學檢（jiǎn）查

常規檢查（chá）包括利用檢眼鏡對（duì）玻璃體和眼（yǎn）底進行（háng）觀察。使用直（zhí）接檢眼鏡和（hé）間接檢眼（yǎn）鏡（jìng）可詳細檢查眼底。本原（yuán）則建議，除拍照外，還應簡述檢查（chá）結果並記錄，並將這些記錄與相應的詳細記錄一同（tóng）保存。

眼壓是衡（héng）量前房角功能變化的重（chóng）要參數。FDA指導原則提到了使用眼壓計的方法（fǎ）（FDA/CDER，2008）。在非臨床毒性試驗中，常用扁平眼壓（yā）計、回彈式眼壓計或（huò）空氣式眼壓計來測（cè）量眼壓。在滴眼給藥毒性試驗中，使用眼壓計（jì）有幾點（diǎn）注意事項。首先，為了獲得準確的眼壓值，有必要使動物適應眼壓計。在測量之前，如果動物（wù）沒有適應眼壓計，通常情況（kuàng）下測出（chū）的眼壓值會偏（piān）高，從而導致無（wú）法正（zhèng）確判斷藥效（xiào）。其次（cì），由於儀器會接觸角膜表麵，眼壓測量操（cāo）作可能會在某種程度上損傷角膜上皮細胞。因（yīn）此，應慎重決定檢查的組別（bié）及檢查順序，以避免眼部過度應激，並防止過度（dù）應激影響其他結果的解（jiě）讀。

通過全視野視網膜（mó）電圖檢查（ffERG）可檢測視網膜的功能變化。理想的做法是使用國（guó）際臨床視覺電生理協會（ISCEV）建議（yì）的方法，因為此方法可在進行全視野視網（wǎng）膜電圖檢查時識別視錐細（xì）胞和視杆細胞（bāo）的變化。然而，此（cǐ）方法不適用於在有限時間內對（duì）大量動物進（jìn）行檢查的情況。ISCEV方法擬用（yòng）於隨診檢查（chá），可能僅適用於（yú）ERG檢查發現異常的情況。例如，Penha等人（2010）報告稱，角膜混濁或晶體混濁會影響光線到達視網膜，而麻醉也（yě）會（huì）影響全視野視網膜（mó）電圖的檢查結（jié）果。

可選檢（jiǎn）查

關於（yú）淚膜檢查，Schirmer試驗和酚（fēn）紅（hóng）線試驗用於淚液體積的定量分析。進行Schirmer試驗和酚紅線試驗時，分別使用無毒濾紙或棉（mián）線浸潤於pH指示劑酚紅溶（róng）液中，然後插入結膜囊內（nèi）進行淚膜檢測。淚膜的其他臨（lín）床檢查包（bāo）括淚膜破裂時（shí）間。此前已有研究者報告了犬（quǎn）和兔的淚膜破裂時間，這些測（cè）試能夠揭示淚（lèi）腺的功能狀態。此（cǐ）外，眨眼頻率（lǜ）也可以間接說明供試品是否對角膜產生了刺激。

由（yóu）於眼科成像技術的（de）進步，現在能（néng）檢測出常規眼科學檢查難以（yǐ）察覺的變（biàn）化。例如，角膜（mó）共焦顯微鏡檢查能夠捕捉到角膜上皮的細微（wēi）變化；角膜內皮顯微（wēi）鏡（jìng）檢查能（néng）夠（gòu）觀察到角膜內皮的形態和密度變化；光學相幹斷層掃（sǎo）描（OCT）對於視網膜的觀察非常有力。這些成像技術均可用於（yú）滴眼給藥毒性試驗中的動物（wù）檢查，能夠（gòu）生成（chéng）高（gāo）分（fèn）辨率的圖像，滿（mǎn）足組織病理學檢查（chá）的要求。

滴眼給藥毒性試驗的其他常用（yòng）眼前節檢查包括定量測量角膜厚（hòu）度的測厚儀和定量測量前房房水（shuǐ）閃輝的激光房水閃光細胞儀。如（rú）果眼後節的視網膜出（chū）現局部異常，多焦視網膜電圖（mfERG）能夠捕捉到相應的（de）電生理信號。利用眼底（dǐ）血管熒光造影能夠觀察到視網膜和脈絡膜的原有（yǒu）血管（guǎn）及新（xīn）生血管的滲透性。

Kontadakis等人（2014）指出，淚膜中的細胞因子和生長因子（zǐ）作為（wéi）生物標記（jì）物，能預示（shì）眼表疾病。有研究者報告稱（chēng），血清細（xì）胞因子是預（yù）示老年黃斑變性的生物標記物。生物標記物能用於非侵入性（xìng）方式觀察藥物誘導的眼毒性反（fǎn）應。然而，目前這樣的生物標記物數量仍然有限。反過來，上述的各種眼部成像技術可能可替代生物標記物，用於觀（guān）察和研究（jiū）人和動物的（de）眼毒性。

05、眼及附屬組（zǔ）織的（de）病理學檢查

組織病理檢查是滴眼給藥（yào）毒性（xìng）試驗的重要（yào）組成部分。最（zuì）近，多篇（piān）文獻綜述一致強調了組織病理學檢查在藥物（wù）評估中的重要性。在滴眼（yǎn）給藥毒性試驗中，供試品的最（zuì）大暴露量不僅出現在角膜上皮，還出（chū）現在結膜（mó）和排泄係統，包括鼻（bí）淚管的粘膜和鼻（bí）腔。因此，需要（yào）特別注意細致檢查（chá）這些組織。淚腺、哈氏腺（若（ruò）有）、鼻腔和瞬膜（若（ruò）有）也應進行組織病理學檢查。為了準（zhǔn）確地進行組織病理學評估分析，必須嚴格考量組（zǔ）織病理切片的質量。如今已有多篇關於這一（yī）方麵的文章發表，詳細闡述了切片的各種技術考量。